產(chǎn)品列表 / products
操作規(guī)程
一、復(fù)蘇
1、事先用Matrix進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理。平時(shí)Matrix保存在-20℃,使用之前放在4℃冰箱或冰上進(jìn)行解凍。待Matrix解凍后,按1:100的比例迅速用PBS液體稀釋。按6孔板每孔加1ml,150px皿加2ml,250px皿加3ml的量加入,加入后迅速搖動皿/板,使加入的Matrix*覆蓋整個(gè)皿底。放到37℃培養(yǎng)箱中4小時(shí),使用前去掉包被液(如果暫時(shí)不使用,用封口膜密封,在4℃冰箱能保存一周)。
2、復(fù)蘇前準(zhǔn)備iCell解凍*培養(yǎng)基(iCell解凍液基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell解凍液添加劑)。加入適量的解凍液(6孔板每孔加2ml,150px皿加3ml,250px皿加9ml),另加入10ug/ml的Y27632因子,放入37℃培養(yǎng)箱中。
3、復(fù)蘇一支細(xì)胞用5ml的上述混合培養(yǎng)基,復(fù)蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預(yù)熱。從液氮罐里取出凍存管后,迅速轉(zhuǎn)移到生物安全柜中(如果液氮罐的位置距離安全柜遠(yuǎn),要用裝有液氮的容器把凍存管轉(zhuǎn)移到安全柜),并用加熱好的*培養(yǎng)基進(jìn)行解凍(用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養(yǎng)基,交換溶解開的細(xì)胞,直至*溶解)。
4、200Xg離心5分鐘,去掉上清液,加入1ml的iCell*解凍培養(yǎng)基(含10ug/ml的Y27632因子),用手指彈碎管內(nèi)沉淀。按接種到每孔板/皿1ml的量,補(bǔ)充iCell*解凍培養(yǎng)基到離心管中,輕輕吹吸三四次后加入培養(yǎng)皿/板中。水平十字振動使細(xì)胞均勻分布,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
5、24小時(shí)后換成iCell*培養(yǎng)基(iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加劑)。以后每隔22—24小時(shí)換液。細(xì)胞長滿80-90%需要傳代或凍存。
二、傳代/凍存
1、傳代前要進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理,做法與復(fù)蘇時(shí)相同。培養(yǎng)基為iCell*培養(yǎng)基,同時(shí)加入10ul/ml的Y27632因子。
2、傳代/凍存前,準(zhǔn)備37℃預(yù)熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液(0.5mM EDTA+0.025%胰酶)。
3、吸走iCell*培養(yǎng)基,并加入37℃預(yù)熱好的PBS溶液清洗二次。
4、加入適量(按6孔板每孔加1ml,150px皿加2ml,250px皿加3ml的量)的37℃預(yù)熱好的傳代工作液。
5、37℃放置4-5分鐘(前一分鐘過后拿出來,用手指輕彈幾下板/皿的底部),顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)間隙但尚未相互分離,肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白,表明細(xì)胞消化時(shí)間理想。
6、迅速吸去傳代液,加入適量的iCell*培養(yǎng)基終止消化,用移液器扇形吹打皿/板底部(吹打不用超過10次),使附著的細(xì)胞集落脫落。(如果消化時(shí)間不當(dāng),致使細(xì)胞*從皿/板底剝離的情況,不用吸出傳代液,加入同等量的iCell*培養(yǎng)基終止消化)。
7、移入離心管,離心后重懸。傳代比例為1:8—1:12;凍存按6孔板每孔凍1支,150px皿凍2-4支,250px皿凍6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell*培養(yǎng)基與10%的DMSO。
8、復(fù)蘇時(shí)按凍存前的1:4—1:6的比例進(jìn)行。
注意事項(xiàng)
1、每次換液時(shí)要觀察細(xì)胞生長狀況以及細(xì)胞形態(tài)的變化并對細(xì)胞進(jìn)行拍照,但是在培養(yǎng)箱外操作的時(shí)間不要過長,避免因溫度對細(xì)胞生長狀態(tài)造成不利影響。
2、更換培養(yǎng)基之前,要對新的培養(yǎng)基進(jìn)行37℃預(yù)熱。為了避免反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的培養(yǎng)基中各種成分的影響,只對本次要更換的量進(jìn)行預(yù)熱處理。
3、用移液器吹打細(xì)胞,因?yàn)橐埔汗艿亩瞬枯^為圓滑,對細(xì)胞傷害的程度小于用1ml的槍。
4、細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)要及時(shí)傳代,否則會造成細(xì)胞形態(tài)的變化。但是,如果細(xì)胞在鋪板時(shí)混合不均勻,而形成部分集落過大的情況,即使沒有達(dá)到80-90%也要進(jìn)行傳代。
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