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怎么從 -80℃ 凍存的抗凝全血中提取RNA

更新時(shí)間:2020-07-01 點(diǎn)擊量:2070

實(shí)驗(yàn)材料:
-80℃ 冷凍 75 天的抗凝全血;預(yù)先按 500 µl 血樣比 1 ml Buffer L9 的比例加入 Buffer L9 的同一個(gè)抗凝全血樣本作為對照組(備注:Simgen 全血總 RNA 試劑盒中的 Buffer L9 與抗凝全血預(yù)混后可在-20℃ 長期凍存,RNA 不會降解)。

實(shí)驗(yàn)試劑:
全血總 RNA 試劑盒(simgen,Cat.No.5201050)、
cDNA 鏈合成試劑盒(simgen,Cat.No.7306025)、
2×SYBR Green PCR Mix(simgen,Cat.No.7106100)、
人 β-actin 引物(Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG
/Reverse:  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG)

實(shí)驗(yàn)方法:
1. 分兩組進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn),每組各做兩管:第fist組取 2 個(gè) 2 ml 離心管,各加入 500 µl 新鮮全血,編號 1、2;第二組加入 500 µl 新鮮全血后再加入 1 ml Buffer L9,混合均勻,編號 3、4。將兩組樣本置于 -80℃ 凍存,凍存 75 天。
2. 75 天后取出后置于室溫,待血樣全部融化后,向 1、2 中加入 1 ml Buffer L9 混合均勻;
3. 13000 rpm 離心 10 分鐘;
4. 吸取 700 µl 離心上清轉(zhuǎn)移到裝有 500 μl 無水乙醇的 1.5 ml 離心管中,混勻;
5. 分兩次將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中,離心去濾液;
6. 依次用 500 µl Buffer WA 和 700 µl Buffer WBR 各洗滌一次;
7. 用 50 µl RNase-Free Water 洗脫 RNA;
8. 在微量紫外分光光度計(jì)上測量 RNA 的濃度;
9. 瓊脂糖凝膠電泳;
10.逆轉(zhuǎn)錄制備 cDNA;
11.取 5 μl cDNA 模板進(jìn)行 RT-PCR 檢測。

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