在免疫酶技術中,首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化,便可導致試驗結果產生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
1.酶標記抗體的滴定方法是:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應,以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價,或稱工作濃度。
2.其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內加0.1ml,4℃一夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600(根據據抗體的滴度而定),分別加入反應孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
3.結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值,并以OD為縱座標,結合物濃度為橫座標,繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度,即為該標記物的工作濃度。
上一篇:關于重組蛋白的特性
下一篇:細胞組織塊培養(yǎng)法