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你是否在為做實驗的時候沒有掌握到要點而擔(dān)心?沒關(guān)系上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司來告訴你。ELISA 的技術(shù)要點包括三個方面:試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。
一、反應(yīng)條件的選擇、適工作濃度的選擇
在建立某一 ELISA 測定中,應(yīng)對包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇,以達(dá)到合適的測定條件和節(jié)省測定費用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例,介紹適工作濃度的選擇方法。
(一)間接法測抗體
1.酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇
(1)用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被,洗滌。
(2)將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中,保溫,洗滌。
(3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后,讀取吸光度(A),繪制曲線如圖15-10。讀取A值在 1.0 時的酶標(biāo)抗體稀釋度,作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人 IgG 的工作濃度應(yīng)為1/1600。
2.棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
(1)用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被,洗滌。
(2)將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋,加樣,保溫,洗滌。
(3)加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體,保溫,洗滌。
(4)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。
(5)選擇強陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測定結(jié)果,表中數(shù)字為A值。從表中可見1:200為zui舒適的工作濃度。
各類血清 抗原稀釋度
1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
強陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04
(二)夾心法測抗原
在夾心法 ELISA 法中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度,舉例如下:
夾心 ELISA 包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇
包被抗體的濃度及 參考抗原
酶標(biāo)抗體稀釋度 強陽性(25ng/ml)弱陽性(1.5ng/ml)陰性
10 μg/ml
1:1000 1.17 0.15 0.09
1:5000 0.46 0.03 0
1:25000 0.12 0 0
1 μg/ml
1:1000 >2 0. 25 0.10
1:5000 0.91 0.12 0.01
1:25000 0.25 0.01 0
0.1 μg/ml
1:1000 0.42 0.13 0.13
1:5000 0.11 0.03 0.02
1:25000 0.03 0 0
(1)抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為 10、1 和 0.1 μg/ml,分別在 ELISA 板上進(jìn)行包被,每一濃度包括三個縱行,洗滌。
(2)在一個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液,另一橫行加入弱陽性抗原液,第三橫行加入陰性對照液,保溫,洗滌。
(3)將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個濃度,例如 1:1000、1:5000 和 1:25000。分別加入每一包被濃度的一個縱行中,保溫,洗滌。
(4)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后,讀取 A 值。
(5)以強陽性抗原的 A 值在 0.8 左右、陰性參考的 A 值小于 0.1 的條件作適條件,據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。從表 15-2 可看出包被抗體濃度可選用 1 μg/ml,酶標(biāo)抗體的稀釋度可選為 1:5000。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑,可以此濃度為基點,縮小間距再做進(jìn)一步的棋盤滴定。
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